GENOMIC INSIGHTS FOR SAFETY ASSESSMENT OF FOODBORNE BACTERIA

Abstract

La sicurezza alimentare e l'accesso ad essa sono fondamentali per sostenere la vita e promuovere una buona salute. Gli alimenti non sicuri, contenenti microrganismi o sostanze chimiche nocive, sono causa di oltre 200 malattie, dalla diarrea al cancro, che colpiscono in particolare i neonati, i bambini piccoli, gli anziani e gli individui immunocompromessi. L'onere globale delle malattie di origine alimentare si ripercuote sulla salute pubblica, sulla società e sull'economia, pertanto è necessaria una buona collaborazione tra governi, produttori e consumatori per contribuire a garantire la sicurezza alimentare e sistemi alimentari più solidi. L'indagine più recente condotta dall'OMS (2015) ha evidenziato una stima di 600 milioni di individui malati e 420.000 decessi annui associati ad alimenti non sicuri. L'impatto economico è dovuto principalmente alla mancanza di alimenti sicuri nei Paesi a basso e medio reddito, con una perdita di 110 miliardi di dollari l'anno in termini di produttività e spese mediche. Le sfide principali per garantire la sicurezza alimentare rimangono legate alla nostra produzione alimentare e alla catena di approvvigionamento, dove fattori come la contaminazione ambientale, le preferenze dei consumatori, il rilevamento tempestivo e la sorveglianza dei focolai giocano un ruolo cruciale. Recentemente, le metodologie basate sul DNA per il rilevamento e l'indagine microbica hanno suscitato particolare interesse, soprattutto grazie allo sviluppo delle tecnologie di sequenziamento. Contrariamente ai metodi tradizionali dipendenti dalla coltura, le tecniche basate sul DNA, come il sequenziamento dell'intero genoma (WGS), mirano a risultati rapidi e sensibili a un prezzo relativamente basso e a tempi di elaborazione brevi. Inoltre, il WGS conferisce un elevato potere discriminatorio che consente di determinare importanti caratteristiche genomiche legate alla sicurezza alimentare, come la tassonomia, il potenziale patogeno, la virulenza e la resistenza antimicrobica e il relativo trasferimento genetico. La comprensione di queste caratteristiche è fondamentale per progettare strategie di rilevamento e mitigazione da applicare lungo l'intera catena alimentare secondo una prospettiva di "One Health", che porta ad acquisire conoscenze sul microbiota che influenza l'uomo, gli animali e l'ambiente. Lo scopo della tesi è quello di approfondire la genomica dei microbi di origine alimentare per la loro caratterizzazione e per creare o migliorare le strategie per la loro individuazione e i metodi di mitigazione. In particolare, questa tesi si concentra sulla valutazione del potenziale patogeno sulla base di analisi genomiche che includono studi di tassonomia, virulenza, resistenza agli antibiotici e mobiloma. Il secondo obiettivo è quello di trarre vantaggio dalle conoscenze genomiche per progettare dispositivi di rilevamento rapidi ed efficaci e metodi di mitigazione affidabili per affrontare i patogeni di origine alimentare. Più in dettaglio, saranno trattati i seguenti argomenti: La presenza di ceppi multiresistenti negli alimenti fermentati pronti al consumo rappresenta un rischio per la salute pubblica per la diffusione di determinanti AMR nella catena alimentare e nel microbiota intestinale dei consumatori. Le analisi genomiche hanno permesso di valutare accuratamente la sicurezza del ceppo UC7251 di E. faecium, in relazione alla sua virulenza e alla co-localizzazione dei geni di resistenza agli antibiotici e ai metalli pesanti in elementi mobili con capacità di coniugazione in diverse matrici. Questo lavoro sottolinea l'importanza di una sorveglianza della presenza di batteri AMR negli alimenti e di incitare lo sviluppo di strategie innovative per la mitigazione del rischio legato alla diffusione della resistenza antimicrobica negli alimenti. L'accuratezza dell'identificazione tassonomica guida le analisi successive e, per questo motivo, un metodo adeguato per identificare le specie è fondamentale. È stata studiata la riclassificazione delle specie di Enterococcus faecium clade B, utilizzando un approccio combinato di filogenomica, tipizzazione di sequenza multilocus, identità nucleotidica media e ibridazione digitale DNA-DNA. L'obiettivo è dimostrare come l'analisi del genoma sia più efficace e fornisca risultati più dettagliati riguardo alla definizione delle specie, rispetto all'analisi della sequenza del 16S rRNA. Ciò ha portato alla proposta di riclassificare tutto il clade B di E. faecium come E. lactis, riconoscendo che i due gruppi sono filogeneticamente separati, per cui è possibile definire una specifica procedura di valutazione della sicurezza, prima del loro utilizzo negli alimenti o come probiotici, compresa la considerazione per l'inclusione nella lista europea QPS. A partire da questa riclassificazione tassonomica, abbiamo sviluppato un metodo basato sulla PCR per la rapida individuazione e differenziazione di queste due specie e per discutere le principali differenze fenotipiche e genotipiche da una prospettiva clinica. A questo scopo, è stato utilizzato un allineamento del core-genoma basato sull'analisi del pangenoma. La differenza allelica tra alcuni geni del core ha permesso la progettazione di primer e l'identificazione della specie mediante PCR con una specificità del 100% e senza reattività crociata. Inoltre, i genomi clinici di E. lactis sono stati classificati come un rischio potenziale a causa della capacità di aumentare la traslocazione batterica. Gli agenti antimicrobici alternativi agli antibiotici sono una delle principali aree di sviluppo e miglioramento dell'attuale catena alimentare. Le nanoparticelle metalliche, come le nanoparticelle di platino (PtNPs), hanno suscitato interesse per le loro potenti attività catalitiche simili alle ossidasi e alle perossidasi che garantiscono forti effetti antimicrobici, e sono state proposte come potenziali candidati per superare gli inconvenienti degli antibiotici come la resistenza ai farmaci. L'obiettivo è studiare la modalità d'azione delle PtNPs in relazione alla capacità di formazione del biofilm, al meccanismo di contrasto delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) e al quorum sensing utilizzando batteri di origine alimentare come Enterococcus faecium e Salmonella Typhimurium.